Analysis of interactions between viral replicase proteins and plant intracellular membranes.
Sanfaçon, H. et Zhang, G. (2008). « Analysis of interactions between viral replicase proteins and plant intracellular membranes. », dans Foster, G., Johansen, E., Hong, Y., and Nagy, P. (dir.) - Plant Virology Protocols: From Viral Sequence to Protein Function. Series: Methods in Molecular Biology. Vol. 451, Humana Press Inc, USA, Chapitre 3, p. 361-376, DOI: 10.1007/978-1-59745-102-4.
Résumé
La réplication du génome des phytovirus à ARN de polarité positive a lieu dans des complexes entourés d’une membrane qui renferme les protéines de la réplicase virales, l’ARN viral et des protéines de l’hôte. Bon nombre des protéines de la réplicase virale jouent un rôle déterminant dans l’assemblage des complexes de réplication au niveau des membranes intracellulaires. Il s’agit de protéines membranaires intégrales qui interagissent directement avec les membranes et amènent au complexe d’autres protéines ainsi que l’ARN viral par des interactions protéine-protéine ou protéine-ARN. Dans ce chapitre, nous décrivons des méthodes de fractionnement subcellulaire qui permettent de déterminer si les protéines virales sont des protéines membranaires intégrales in planta. Des techniques de centrifugation différentielle nous permettent d’obtenir des fractions riches en composantes membranaires dans lesquelles nous pouvons rechercher les protéines de la réplicase virale par immunotransfert. Nous confirmons l’association membranaire par des épreuves de flottation et le traitement des fractions riches en composantes membranaires en condition de forte salinité ou de pH élevé suivis de la détection des protéines virales. Comme bien des phytovirus se répliquent en association avec le réticulum endoplasmique, nous examinons aussi deux techniques permettant d’étudier spécifiquement l’interaction des protéines virales avec ce type de membranes. Il s’agit du fractionnement dans un gradient continu de sucrose en présence ou en l’absence de Mg2+ 3 mM et d’épreuves de glycosylation.
